一、斑马鱼鱼房的管理

1、人员管理

斑马鱼养殖人员及实验操作人员岗前接受培训。培训内容包括：斑马鱼房设施的特点、斑马鱼房管理方法及操作规程等。

2、合理安排各项***的事项

斑马鱼房常用器具需定期******。捕捞斑马鱼的渔具和收集受精卵的滤网需浸泡在***液中，使用前后用清水充分冲洗。使用完毕后放回***液中浸泡。***液需每周更换。玻璃器皿需定期高压***。其它不适于高压***的器皿，应使用***液******。斑马鱼房墙面和地面需每周使用***液清洗***。

斑马鱼房隔离养殖区的任何器具在未经***处理前不得带离该区域。在隔离养殖区收集的受精卵需经过***后方可转移至斑马鱼房内部养殖区养殖。

3、斑马鱼养殖系统的维护及保养

金水海洋公司的斑马鱼养殖系统是一种较为复杂、价格昂贵的大型贵重仪器，而且需要连续运转，因此对设备的维护保养至关重要。为了保证斑马鱼养殖系统的正常运行，斑马鱼房管理人员需坚持如下的检查项目：

3.1、 每天检查系统运行电压等参数是否符合系统运行的要求。

3.2、 检查紫外灯是否正常工作。

3.3、 检查系统pH、温度、电导率及溶氧度是否在规定范围内。

3.4、 定期清洗各种检测探头。

3.5、 每周检测养殖水中的氨氮含量。

3.6、 每天更换或清洗PP精密过袋

3.7、 每月检查斑马鱼养殖系统的控制系统及报警系统的各种开关、换能器、电池、表头和保险丝的接触情况和运行情况，确保机组正常运行。

3.8、 空调机、排风机要经常保养。

3.9、 与金水海洋公司建立系统年检制度，每年对系统做系统***的维护。

4、斑马鱼房巡视制度

每天早晚两次由专人检查斑马鱼养殖区养殖缸及斑马鱼状态。如发现病死鱼需及时处理，并做记录。

5、物品及养殖耗材的管理

斑马鱼鱼房的养殖耗材需统一存放，并建立领用登记制度。同时，为了保证环境的清洁度，应尽量减少人员进出的次数及保证物品的***、***。物品进入斑马鱼房之前，必需经******处理。

二、斑马鱼常规养殖条件

斑马鱼的健康养殖是开展一切斑马鱼有关的研究工作的基础。斑马鱼的实验室饲养过程中，以下的一些环境条件对于斑马鱼的存活、健康、和繁殖传代至关重要。

1、温度

斑马鱼是一种小型热带淡水鱼类，可以耐受比较广的温度。***耐受的温度范围为6至38?C。一般认为28.5?C是斑马鱼养殖的***适温度，通常情况下鱼房温度控制设置在28?C。较高的养殖温度可能导致水体的溶氧度降低，且造成水体中***的滋生，影响斑马鱼的健康。而过低的养殖温度会造成斑马鱼的生长发育放缓，产卵量降低。

2、pH值

水体的pH值对鱼类的生长繁殖具有重要的影响。目前，仍然缺乏系统的实验结果确定斑马鱼生长繁殖的***pH值。大部分斑马鱼养殖设备维持水质pH值在7.0-8.0左右，这也是大部分淡水鱼类生活的pH范围。斑马鱼相对可耐受一定的碱性环境，酸性环境，尤其pH低于6.0会造成斑马鱼死亡。

3、硬度

水的总硬度指水中Ca2+和Mg2+等离子的总浓度。斑马鱼适宜于较高硬度的水，水体硬度超过100mg/L CaCO3有利于斑马鱼的生长繁殖。但是，这种适应是有限的。目前，尚没有系统***的研究不同范围的硬度条件对斑马鱼生长发育方面的影响。

4、盐度

斑马鱼属淡水鱼类，但是能够耐受很大的盐度范围。斑马鱼养殖的适宜盐度通常为0.25‰。养殖系统的盐度控制范围为0.25-0.75‰。养鱼水：以约0.06g海盐加入1L的蒸馏水中（终浓度约60μg/ml），充分溶解即可。

5、溶解氧

溶解氧是鱼类养殖中的重要条件参数。低水平的溶解氧往往会造成养殖系统内鱼类的大量死亡。斑马鱼具有较快的新陈代谢速率，因而消耗氧气的水平也比较高。建议养殖水体的溶解氧水平基本维持或者不低于6.0mg/L （28.0?C），以维持斑马鱼的健康生长和活动。

然而水体溶氧度也不是越高越好。水体内通空气过度，会造成气体达到和超过饱和浓度，产生大量气泡，对鱼造成致命危害，产生气泡病。

6、氨氮废物

养殖水体中的氨主要来源于鱼的腮上皮组织释放和粪便排放。含氮废物的主要来源是水体中的有机物（如死鱼，粪便，漂浮食物）的降解。较高的氨氮浓度对鱼类有毒害作用，同时也会造成水体内的电导率升高。水体中的硝化***可以将氨氮废物转化为亚硝酸盐，进而转化为硝酸盐，因此对于大型的循环水养殖系统，培养和维持水体内的硝化***水平对水体健康非常重要。较低浓度的硝酸盐对鱼类基本无害，但是浓度超过200ppm，就可能对斑马鱼的健康造成影响。因此，监控水体内的氨氮水平，和硝酸盐浓度对维持一个健康的养殖水系是很重要的。

7、光周期/光照强度

适宜的光周期有利于斑马鱼生长繁殖。斑马鱼在经历暗周期后，光照诱导斑马鱼开始交配产卵，并且交配产卵可以持续一小时左右。24小时连续光照可能导致斑马鱼不产卵。

斑马鱼养殖系统的适宜光周期是14小时的光照周期和10个小时的暗周期。同时，照明系统的渐亮和渐暗可以避免刺激斑马鱼，防止斑马鱼从养殖缸内跳出。

斑马鱼养殖的合适光强范围为水体表面的光强在54-324 lux范围内。光照强度过高会导致水体内的藻类大量滋生，影响斑马鱼的健康。鱼房内灯光太暗，光照不足，会造成斑马鱼的条纹灰暗，活力不足。

8、水质调控

水质调控的基本项目有：盐度、pH值。保证这些水质指标都控制在养殖对象的适应范围内。一般要求斑马鱼养殖水体的pH值在7-8之间，电导率在500-800μS/cm。金水海洋公司有专门的调控系统对于以上指标应能够实时自动监测，发现某个指标异常，即时自动调整。

三、斑马鱼的饲养和传代

1、斑马鱼的饲养

斑马鱼的***适生长温度为28.5?C。受精卵被收集之后，5天之内的胚胎可在培养皿内静水培养。可以使用普通养鱼水或者胚胎培养基，置于28.5?C恒温温箱内，每天换水，培养密度不宜超过每个培养皿（90mm）50个胚胎。斑马鱼胚胎在5天之内不需喂食。

5到15天的幼苗，可以转移到大的培养器皿中继续静水培养。1L体积内不宜放置超过100尾幼苗。每天需要更换至少50%体积的水。可在培养用水或溶液中加入1/10000体积的亚甲基蓝，抑制霉菌生长。斑马鱼的幼苗在出生后第5天开口进食，在此阶段及时提供食物可以促进斑马鱼幼苗的成活率。斑马鱼幼苗常见的食物是新鲜孵化的草履虫（paramecia）或者轮虫（rotifer）。每天喂食2-3次。

15天以上的幼苗，可以开始使用滴水法的近似静水培养，不需继续换水。如果条件不具备，需要继续静水喂养，则需要使用更大体积的养殖水，1L体积内不宜放置超过30尾幼苗。15天以上的斑马鱼可以开始喂食丰年虾（artemia，又称丰年虫，卤虫）的幼虫，***喂食2-3次。其中12天至15天的幼苗，可以采用草履虫和丰年虾混合喂养的方式，让幼苗适应新食物。

30天以上的幼鱼，可以开始正常上架，进入水循环系统。养殖密度以5尾/L为佳。***应喂食2-3次丰年虾的幼虫，也可搭配喂食固体颗粒饲料。正常喂养的情况下，3个月大的斑马鱼即可性成熟，交配产生下一代。

2、斑马鱼的配鱼和鱼卵收集

斑马鱼的交配行为需要光周期的生物钟控制，在每次光周期开始时应激进入交配产卵的状态。这时候雌雄鱼相遇则有可能交配产卵。健康的斑马鱼性成熟后即可开始交配产卵，6个月到18个月大的斑马鱼是生产的高峰期，一对健康的斑马鱼一次交配可产受精卵200枚以上。

配鱼时间应在需要收集鱼卵的前***傍晚。使用配鱼专用缸，把内缸（底部有漏网）套入外缸之内，加入约2/3缸水，用隔板把雌雄鱼分开（图2.3）。每缸按照雌雄鱼1:1或者2:1的比例放置鱼。密度不宜过高。

图2.3 建立自然交配和鱼卵收集。左侧，配鱼样式，在外缸内放置内缸，一雌一雄以隔板分开。缸内加水2/3或3/4，盖上缸盖。右侧，以培养皿收集到的斑马鱼鱼卵。

第二天早晨，光周期开始后，可按需要的时间把隔板抽开，让雌雄鱼交配产卵。一般相互接触后雄鱼会追逐雌鱼，15分钟之后雌雄鱼开始交配产卵。所产受精卵会从内缸底部漏下，进入外缸，避免成鱼接触和吃掉受精卵。每次收集受精卵都可直接将内缸拿出，换入另外一个外缸，把原缸内的受精卵随手倒入收集网内，用水冲洗到培养皿内（图2.3）。

如果收集受精卵是为进行显微注射实验，则可通过设定抽开隔板时间，控制雌雄鱼接触的方法控制受精卵的年龄，保证收集到同一时期的受精卵。但是光周期开始2小时后，雌鱼如果未能接触到雄鱼，则开始消化体内未排出的卵，鱼卵质量开始下降。所以受精卵收集工作应尽量在光周期开始后2小时内进行。

本节附录：

草履虫培养：将小麦粒干热***后，加水煮15分钟，分装在无菌容器内，4?C保存备用。在每1L净水中加入1g酵母粉，1ml全脂牛奶，1gNaCl，混入约15粒煮熟的麦粒，接入2ml草履虫种源，静置培养5-7天左右可用。

丰年虫培养：在12L水中，加入约300g海盐，1勺NaHCO3（6-10g），50g丰年虫卵，通气培养24小时可用。

斑马鱼的体外受精技术

斑马鱼作为实验工具的一大优势是体外受精，精子可冻存，保持较长时间的活力。在常规的实验操作中，体外受精也提供自然交配产卵无法完成的帮助。例如在实验中一次性需要大量的同基因型胚胎，或需要严格同一时间受精的同龄鱼卵，或鱼本身有缺陷无法完成自然交配的过程的情况下，体外受精都可满足实验所需胚胎收集要求。

做体外受精之前***，应和自然配鱼一样，把雌雄鱼在同一缸内分隔放置。做体外受精的当天早晨，需配制新鲜的Hank’s buffer。

做体外受精，首先收获精子样品。以浓度为0.016% 的tricaine麻醉雄鱼，用柔软吸水的纸吸净鱼身上的水分。吸干水分对于取得可长时间保存的精子样品非常重要，精子遇水则被***，如不能与卵接触则很快失去活性，所以要尽量吸干鱼身上的水分，尤其是泄殖孔（cloaca）周围的水分，避免水分混入精子样品。将麻醉好的雄鱼固定在海绵垫上，以圆头或扁头，表面和边缘都很光滑的镊子，轻轻挤压雄鱼的腹部，同时用毛细针吸入乳白色的精子样品（图2.4）。将收获的精子样品（1-2μl）溶于50μl Hank’s buffer，置于冰上保存。质量好的精子样品在4?C保存的条件下，可保持活性2-3天。

精子样品准备好后，可以开始收获未受精鱼卵。同样将雌鱼麻醉，并吸干鱼身上的水分，置于小号培养皿内，用润湿的手指轻轻按压雌鱼的腹部，得到未受精的鱼卵。质量好的鱼卵为粘稠状、淡金黄色。收获的鱼卵如果颜色苍白、或水状、或内部含有絮状物，则为质量差的鱼卵或者死卵，无法被正常受精，应该弃之不用。收获到质量好的鱼卵之后，迅速将混有精子样品的50μl Hank’s buffer与之混合，然后加入750μl养鱼水***精子。室温放置3-5分钟后，可加入养鱼水至培养皿的2/3体积，将培养皿放入28?C培养箱。体外受精完成。

图2.4 体外受精实验，分别收获精子和卵子。左图为以毛细针收获精子的操作，高质量的精子样品为乳白色。右图为高质量的未受精鱼卵，为粘稠状、淡金黄色。（引自：J vis 2009， PMID：19581874）

受精完成后3-5小时，应把受精卵与未能受精的卵和死卵分开，单独放入90mm培养皿进行培养。如果体外受精的胚胎用于显微注射，则在卵子和精子混合10分钟后可开始进行显微注射实验。